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熒光素酶報(bào)告基因

簡要描述:熒光素酶報(bào)告基因是指以熒光素(luciferin)為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的過程中,會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。

  • 更新時(shí)間:2024-03-08
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一、應(yīng)用原理

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子,也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異序列結(jié)合,這些特異性的序列被稱為順式作用元件,轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合,從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報(bào)告基因實(shí)驗(yàn)(luciferase assay)是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段。

其原理簡述如下:

1)構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒,如pGL3-basic等。

2) 將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子,則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá),熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。

3) 加入特定的熒光素酶底物,熒光素酶與底物反應(yīng),產(chǎn)生熒光,通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性,從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。

二、技術(shù)流程

1) 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

2)設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段,將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-basic)中。

3)篩選陽性克隆,測(cè)序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。

4) 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒,提純備用。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照,提純備用。

5) 培養(yǎng)293(或其它目的細(xì)胞),并接種于24孔板中,生長10-24小時(shí)(80%匯合度)。

6) 將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

7)提取蛋白并用于熒光素酶檢測(cè)。

8) 加入底物,測(cè)定熒光素酶的活性。

9) 計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度,并與空載對(duì)照比較。


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