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流式ROS檢測實(shí)驗(yàn)服務(wù)

簡要描述:活性氧(ROS)的流式檢測通常是通過使用熒光探針如DCFH-DA來監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化。

  • 更新時(shí)間:2024-06-17
  • 廠商性質(zhì):代理商
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01選擇熒光探針常用的熒光染料是DCFH-DA,它能夠進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解成DCFH。DCFH隨后可以被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化,生成發(fā)熒光的DCF。

02DCFH-DA是一種用于檢測活性氧ROS的熒光探針,全稱為2,7-二氯熒光素二乙酸酯。其工作原理為:DCFH-DA本身沒有熒光,但可以自由穿過細(xì)胞膜,一旦進(jìn)入細(xì)胞,它會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH,由于DCFH無法穿過細(xì)胞膜,因此熒光探針會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH,生成有熒光的DCF,且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備,在最大激發(fā)波長480nm和最大發(fā)射波長525nm下檢測熒光信號(hào)。

03步驟裝載探針

對于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞,先裝載探針,后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞,先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,后裝載探針。

原位裝載探針:本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜,通常對于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

收集細(xì)胞后裝載探針:按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。



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